Физические события, происходящие при криоконсервации иммортализованных Т-клеток человека

Абстрактный
Криоконсервация является ключевой для проведения клеточной терапии, однако ключевые физические и биологические события во время криоконсервации плохо изучены. В этом исследовании изучался весь диапазон охлаждения, от мембранных фазовых переходов выше 0°C до внеклеточного стеклования при -123°c, включая эндотермическое событие, происходящее при -47°C, которое мы приписывали стеклянному переходу внутриклеточного отсека. Иммортализованную клеточную линию суспензии человека (Jurkat) изучали с использованием криопротектора диметилсульфоксида. Инфракрасная спектроскопия с Фурье-преобразованием использовалась для определения фазовых переходов мембран и дифференциальной сканирующей калориметрии для анализа событий стеклования. Клетки Jurkat подвергли действию к контролируемый охлаждать следовать быстрым, бесконтрольным охлаждать для того чтобы рассмотреть биологические прикосновенности случаев, при номер и функциональность жизнеспособной клетки столб-таяния оцененные до 72 h столб-таяния. Внутриклеточный Стекловой переход, наблюдаемый при -47°C, соответствовал резкому разрыву в биологическом восстановлении после быстрого охлаждения. Никаких других физических явлений, которые могли бы быть связаны с жизнеспособностью или эффективностью после оттаивания, не наблюдалось. Контролируемое охлаждение до температуры не менее -47°С во время криоконсервации клеток Jurkat в присутствии диметилсульфоксида обеспечит оптимальную жизнеспособность после оттаивания. Под -47°C, быстрый охлаждать можно использовать. Это обеспечивает улучшенное физическое и биологическое понимание ключевых событий во время криоконсервации и должно ускорить разработку оптимизированных протоколов криобиологического охлаждения.

Введение
Криоконсервация является ключевой технологией, способствующей доставке клеточной терапии в клинику. Однако многие детали критических клеточных реакций на криоконсервационные стрессы недостаточно хорошо изучены, что ограничивает темпы разработки улучшенных и эффективных протоколов сохранения клеток. Значительная область касается формирования внутриклеточного льда, который, как правило, является летальным событием для клетки [ 1]. Во время равновесной криоконсервации клеточной суспензии, где используется медленное охлаждение в присутствии криопротектора, такого как диметилсульфоксид (ДМСО), сначала во внеклеточном пространстве образуется лед. При этом эффективно удаляется вода и образуется двухфазная система льда и остаточный, лиофильно-концентрированный раствор суспендирующей среды, включающий криопротектор и клетки [ 2, 3]. Осмоляльность этого замораживани-сконцентрированного решения увеличивает по мере того как температура уменьшена и больше форм льда. По мере того как медленный охлаждать развивает суспендировать клетки сожмет по мере того как они потеряют воду для того чтобы попытаться остать в осмотическом равновесии с внеклеточным разрешением. Таким образом, клетки могут избежать внутриклеточного образования льда. Если скорость охлаждения увеличена, будет достигнута температура, при которой клеточная потеря воды не будет достаточно быстрой, чтобы эффективно уменьшить увеличивающийся осмотический градиент между клетками и суспендирующим раствором (неравновесное замораживание). В этот момент оставшаяся в клетке вода может образовывать летальный внутриклеточный лед [ 4 ]. Более глубокое понимание физического состояния внутриклеточного компартмента клеток, которые избегают образования внутриклеточного льда во время равновесной криоконсервации, несомненно, имеет значение для оптимизации технологии и протоколов замораживания.

Стеклование, или стеклование, происходит, когда жидкость начинает вести себя как твердое тело во время охлаждения с минимальным изменением в термодинамических переменных состояния, таких как давление, объем, внутренняя энергия и Энтропия [ 5 ]. Ниже температуры стеклования вязкость превышает 10 12 па.s [5]. Остекловывание не связано с резким изменением энтропии или экзотермы, как видно при замораживании, но есть изменения в термодинамических переменных реакции, таких как теплоемкость и тепловая экспансивность. Следовательно, Стекловой переход может быть обнаружен дифференциальной сканирующей калориметрией (ДСК), регистрирующей изменение теплоемкости [ 6 ].

Внутриклеточная витрификация, однако, более сложна, чем в простых объемных жидкостях, поскольку внутренняя часть клетки содержит переполненную коллоидную суспензию. В предыдущих исследованиях равновесного охлаждения микроорганизмов в их природной среде и в условиях, имеющих значение для криоконсервации, было показано, что внутриклеточный компартмент становится все более вязким и со временем подвергается коллоидному стеклования с продолжающимся охлаждением [ 6, 7]. Аналогично, клетки млекопитающих в суспензии, которые подвергаются осмотическому стрессу, дегидратируются и сжимаются, а плотность упаковки белков и органелл во внутриклеточном компартменте увеличивается до прохождения стеклования, аналогичного коллоидному стеклования [ 8 ]. Коллоидное стекло обладает свойствами плотной суспензии коллоидных частиц, а не молекулярного стекла и ведет себя как молекулярное сито [ 9 ], позволяя свободное прохождение малых молекул, ограничивая диффузию больших.

Эти широко распространенные случаи витрификации будут одновременны с ударом пониженной температуры на индивидуальных компонентах клетки, как переход участка липида клеточной мембраны и уменьшенная метаболически деятельность. Однако температура этого коллоидоподобного стеклования ранее не сообщалось для клеток млекопитающих, и его влияние, вместе с влиянием связанных биологических событий, на результаты криоконсервации не известно. Типичные протоколы криоконсервации для клеток млекопитающих охлаждаются с контролируемой скоростью до некоторой произвольной конечной точки, такой как -80°C или ниже внеклеточного стеклования. Оптимизация этой конечной температуры позволит разработать более эффективные, последовательные и оптимальные протоколы криоконсервации клеток.

В этом изучении мы использовали клетки Jurkat, immortalized линию людских клеток лимфоцита T, как исследовательская система уместности к cryopreservation и регенеративной медицине. Измеряли физические события, происходящие в образцах клеток Jurkat во время обычной криоконсервации. Простая бинарная система, содержащая раствор криопротектора и белок в различных концентрациях, также использовалась для моделирования элементов внутриклеточного компартмента во время криоконсервации, чтобы лучше понять основную физику физических событий, наблюдаемых в клеточных образцах. Эти данные были положены в перспективу к жизнеспособным отсчетам клетки и клетчатой, метаболически деятельности, соединить физические случаи и биологические исходы для оптимизировать уравновешени-замерзая протоколы.

Материалы и методы
Клетки и культура клеток
Клетки Jurkat получали из Sigma-Aldrich, Gillingham, UK (#88042803, клон E6-1, TIB-152) [ 10 , 11 ] и культивировали в среде RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, #r8758). К этому добавляли 10% v/v обогащенную железом эмбриональную сыворотку теленка (Sigma-Aldrich, #C8056), 2% v/v пенициллин-стрептомицин (Sigma-Aldrich, #P4333) и 1% v / v раствор Амфотерицина B (Sigma-Aldrich, #2942). Эта дополненная среда далее называется полной культуральной средой (CCM). Серия культуральных колб T175 (ThermoFisher Scientific, Roskilde, Дания, #10246131), содержащих по 50 мл CCM, была засеяна 10 6 клетки инкубировали в атмосфере 5% CO2 в увлажненном инкубаторе при 37°C. CCM изменяли в дни 2, 4 и 7 после посева и клетки собирали, когда их плотность достигала приблизительно 0.5×10 6 клеток мл -1. Суспензии клеток переносили в 50 мл центрифужные пробирки (Sigma-Aldrich, #CLS430791) и центрифугировали при 1200 об / мин в течение 4 минут в центрифуге Heraeus Megafuge 16, оборудованной 3655-качающимся ковшовым Ротором (ThermoFisher Scientific). Супернатанты отбрасывали, клеточные гранулы объединяли и затем ресуспендировали в небольшом объеме CCM. Образец 100 мкл конечной клеточной суспензии удаляли для оценки жизнеспособности.

Стеклование
Измерения дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) проводили , как описано ранее [ 6, 7], на гранулах клеток или растворах криопротекторов с использованием калориметра компенсации мощности (Diamond, Perkin Elmer LLC, Norwalk, CT, USA), оснащенного устройством охлаждения жидким азотом (CryoFill, Perkin Elmer LLC). Калибровку температуры проводили с использованием циклогексана (кристаллокристаллический переход при -87,1°с), ртути и галлия (температуры плавления при -38,6°с и +29,8°с соответственно).

Для клеточных измерений приблизительно 10 8 клеток Jurkat в 10% ДМСО (v/v) в CCM гранулировали при 13 000 г в течение 10 минут, затем переносили в 2-мл пробирку Эппендорфа и снова гранулировали дважды при 16 000 г в течение 5 минут, причем супернатант отбрасывали между каждым циклом. Приблизительно 25 мг гранулы клеток Jurkat помещали в алюминиевые кастрюли 50 мкл Perkin Elmer DSC и герметично закрывали.

Кроме того, были исследованы некоторые неклеточные растворы. Сканировали криопротекторные растворы, состоящие из бычьего альбумина (Sigma-Aldrich, #A2153), суспендированного в Криосторе 10 (Sigma-Aldrich, #C2874), собственной криоконсервационной среде, содержащей 10% ДМСО, в инкрементных концентрациях от 0 до 50% мас/мас. Это моделирует внутриклеточную макромолекулярную среду в упрощенном бинарном растворе и может пролить некоторый свет на криопротекторные эффекты сыворотки [ 12 ].

Для клеточных и неклеточных экспериментов в качестве эталона использовали пустую кастрюлю. Различные линейные скорости охлаждения 1, 2 или 10°C мин -1 применяли между 20°C и -150°C и образцы затем нагревали до 20°C при 10°C мин -1 .

Температуры стеклования (Tg’,°C) и удельные теплоемкости (Delta Cp, J g -1 °C) рассчитывали по данным теплового потока , зарегистрированного при нагревании [ 6, 7 ]. Их производные по сравнению с температурой были рассчитаны, чтобы лучше визуализировать переходы стекла с пиком на выходе, идентифицированным как отличающийся от собственного шума машины, когда первая производная теплового потока достигла значения дельты не менее 2,5 МВт с -1. Там, где конец события стеклования перекрывался таянием льда и выступал в виде плеча в производной теплового потока, вычисляли вторую производную для определения пикового значения. В конечном счете, события стеклования характеризовались различными значениями: 1) началом первой производной теплового потока, которую можно рассматривать как температуру начальной молекулярной подвижности при нагреве; 2) половиной экстраполированного теплового потока и максимумом первой производной теплового потока, соответствующей средней температуре стеклования.; iii) концевой набор первой производной теплового потока, который рассматривался как температура начальной потери молекулярной подвижности при охлаждении. Результаты были получены по меньшей мере из трех отдельных циклов охлаждения-нагревания.

Фазовый переход липида мембраны, нуклеация льда и плавить льда
В параллели к клетчатым измерениям DSC, малая часть лепешки клетки была использована для того чтобы измерить переход участка липида мембраны спектроскопией преобразования Фурье ультракрасной (FTIR). Для этого спектрометр Nicolet Magna 750 FTIR (Thermo Fisher Scientific, Madison, WI, США) оснащен детектором ртути/кадмия/теллурида (MCT) и держателем ячейки с переменной температурой (Specac Ltd., Orpington, UK). Образец ячейки помещали между двумя окнами из фторида кальция диаметром 32,0 мм и толщиной 3,0 мм (ISP Optics, Рига, Латвия). Эти просвечивающие окна держали образец в месте, пока позволяющ проходу ультракрасного света необходимо для измерений. Образец после этого был установлен в держателе клетки Specac.

Процедура анализа была описана Готье и др. [13 ]. Вкратце, спектры FTIR были записаны в области среднего ИК-диапазона от 4000 до 900 см -1 с разрешением 4 см -1, из 32 совместно добавленных сканирований с использованием программного обеспечения Omnic (версия 7.1, Thermo Fisher Scientific). Их получали с 45-секундными интервалами при охлаждении от 37°C до -50°C и нагревании до 60°C со скоростью 2°C мин -1. при этом непрерывно продувают оптический стенд сухим воздухом (Balston, Haverhill, MA, USA). Термопара типа-K была помещена как можно ближе к образцу для того чтобы обеспечить непрерывный контроль температуры в течении эксперимента.

Программное обеспечение ASpIR (Infrar Spectra Acquisition and Processing, INRA, Thiverval-Grignon, Франция) использовалось для определения положения интересующих инфракрасных полос колебаний–симметричной растягивающей вибрации CH2 (vCH 2 ) и комбинированной полосы изгиба-либрации H2O. Положение вибрации vCH 2, расположенное на уровне приблизительно 2850 см -1 и обеспечивающее меру конформационного порядка цепей жирных кислот мембранных фосфолипидов [ 14 , 15 ], было идентифицировано как максимумы пиков инвертированной производной второго порядка каждого необработанного спектра FTIR. Сигмоидальная функция была тогда приспособлена к vCH 2 температурные графики. Рассчитывали его производное первого порядка и максимум этого производного принимали за температуру фазового перехода липидов при охлаждении (затвердевание мембраны, ТС) и нагревании (плавление мембраны, ТМ). Для определения зарождения и слияния льда во внеклеточном компартменте использовали комбинационную полосу изгиб-либрация H2O, расположенную между 2150 и 2220 см -1. Во время охлаждения эта полоса сильно смещается от 2150 до 2220 см -1 за счет фазового перехода воды из жидкого состояния в твердое, а при нагревании происходит обратное [ 13]. Поэтому начальные температуры этих зонных сдвигов использовались в качестве температур зарождения льда и таяния льда соответственно. Один пробег был выполнен на независимый образец, в результате чего было проведено три измерения.

Протокол криоконсервации
Суспензию клеток Jurkat готовили в CCM, содержащей 10% v / v DMSO (Sigma-Aldrich, #d4540) при 3×10 6 клеток на мл и аликвотах по 1 мл, добавленных к 2 мл криовьялам (Corning, sourced from ThermoFisher Scientific, #13429798). Флаконы охлаждали при 1°C мин -1 в морозильной камере с регулируемой скоростью замораживания (Asymptote, GEHC, Cambridge, UK). На определенных температурах критической точки между 4°C и -100°C, 5 пробирок извлекли от замораживателя контролируемого тарифа и окунули сразу в жидкий азот (LN). Флаконы хранили при температуре ниже -140°с не менее 24 ч до оттаивания.

Для оттаивания флаконы извлекали из холодильника, помещали в сухой SC2 через оттаивание для флаконов (Asymptote, GEHC) и оттаивали в течение приблизительно 3 минут. После размораживания (подтвержденного визуально отсутствием кристаллов льда) содержимое флакона перемешивали для обеспечения однородности суспензии и 25 мкл помещали в каждую лунку из двух колонок 96-луночного планшета (ThermoFisher Scientific, #10212811), что приводило к приблизительно 75 000 клеток на лунку до того, как будет учтено повреждение криоконсервации. 200 мкл CCM добавляли в каждую лунку, чтобы позволить клеткам культивировать и разбавлять концентрацию ДМСО ниже 1%. 5 пробирок были включены на каждой плите при колонки края заполненные с CCM клетк-свободно для того чтобы уменьшить влияния края.

Планшеты культивировали в атмосфере с 5% CO2 в увлажненном инкубаторе при 37 ° C и оценивали через 24, 48 и 72 ч после оттаивания.

Количество жизнеспособных клеток и метаболическая активность
Подсчет жизнеспособных клеток проводили с использованием диацетата флуоресцеина (FDA, Sigma-Aldrich, # F7378). 1 мкл добавляли в каждую оцененную лунку многолуночного планшета, установленного после оттаивания, и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 20 минут. Общее количество жизнеспособных клеток измеряли при 473 нмекс / 512 нм и рассчитывали с использованием системы визуализации Cytell (GEHC, Amersham, UK).

FDA поглощается клетками и гидролизуется во флуоресцентный продукт внутриклеточными эстеразами, давая меру только тем клеткам, которые сохраняют некоторую метаболическую способность.

Активный дыхательный метаболизм клеток оценивали с использованием натриевой соли Ресазурина (Sigma-Aldrich, #7017). Натриевая соль ресазурина оценивает способность клеток восстанавливать нефлуоресцентный резазурин до флуоресцентного резоруфина. Это измерение показывает относительное здоровье клетки; по мере того как деятельность при предпосылки нежизнеспособными клетками может дать низкие чтения, было выбрано длиннее время инкубации 3 h. Натриевую соль ресазурина разбавляли в ККМ до конечной концентрации 0,005% мас. / В. В каждую исследуемую лунку добавляли 100 мкл с многолуночным планшетом, инкубированным в течение 3 ч при 37°С в 5% СО2. увлажненный инкубатор. Планшеты считывали в считывателе флуоресцентных микропланшетов (Tecan, Männedorf, Швейцария) с помощью программного обеспечения Magellan (версия 7.2, Tecan) при 560 Нм ex /612 Нм em . Лунки, содержащие CCM и натриевую соль Ресазурина без клеток, использовали для получения фоновых значений, вычитаемых из измерений клеток.

Статистический анализ
Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD) повсюду, если иное не указано в тексте. Повторные измерения (обозначенные как n) проводились на независимых биологических образцах, испытывающих те же условия, если не указано иное. Средние значения сравнивались попарно в R (версия 3.4.2) [ 16 ] с использованием пакета R Commander 2.4–1 [ 17 ], а значения P

Результаты
Фазовый переход липида мембраны, нуклеация льда и плавить льда
Первый клеточный физический переход, наблюдаемый при охлаждении суспензии клеток Jurkat в ДМСО, происходил внутри клеточной мембраны ( Рис.1). Данные показывают, что мембранные липиды, обычно находящиеся в жидком и неупорядоченном состоянии при температурах, совместимых с ростом клеток, при охлаждении переходят в упорядоченное состояние геля (черные линии на фиг. 1).). Средняя точка этого перехода определяется как липидную мембрану температура затвердевания (ТС) и появился на -1.0°с ± 0.8°С. внеклеточного льда зарождение произошло в -7.7°с ± 1.4°C. В оба перехода были отменены на потепление, таяния льда наблюдается на -3.4°с ± 0,5°С, а температура плавления липидной мембраны на 5,8°с ± 0,2°с (серые линии на Рис. 1). Исходные данные за средствами были включены в таблицу S1 в качестве дополнительной информации. Кривая, регистрируемая при нагревании, не полностью перекрывала кривую, регистрируемую при охлаждении, что указывает на некоторый гистерезис в мембранном липидном термотропном переходе.

Мембранный липидный фазовый переход клеток Jurkat идентифицируют, следуя положению симметричной валентной вибрации CH2 (νCH2) мембранных цепей жирных кислот с помощью инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием.

Измерения проводились при охлаждении от 37 ° С до -50 ° С (густой черный цвет) и нагреве до 60 ° С (густой серый цвет) со скоростью 2 ° С мин-1. Производные этих кривых были рассчитаны (тонкие линии), а их максимумы были взяты в качестве мембранных фазовых переходов липидов: затвердевание при охлаждении (тонкий черный, Ts), наблюдалось при -1,0 ° С ± 0,8 ° С и плавление при нагревании (тонкий серый, Tm), наблюдается при 5,8 ° С ± 0,2 ° С (n = 3).

Glass transitions
В образцах, первоначально охлаждается на 1°С мин-1 до -150°С, нуклеации льда в межклеточной отсеке произошел от -6°C до -9°С. эндотермический событие (событие в, рис. 2) наблюдается с помощью ДСК при прогревании при -123°c, представляющих среднюю точку стеклования внеклеточной среды (ДМСО, тг е). Эндотермическое событие наблюдалось при дальнейшем нагревании (событие B, Рис. 2), с температурой начала, середины и окончания соответственно -61.4°C ± 1.8, -53.0°C ± 0.7 и -46.9°C ± 1.3°C (в среднем 5 различных биологических образцов ± SD; см. таблицу S2). для необработанного набора данных). Объемное плавление образца сопровождалось большим эндотермическим событием (событие С на фиг.2 ), наблюдаемым до пика при -4°С. Также проводили измерения DSC бесклеточных супернатантов (CCM с добавлением 10% v/v DMSO в отсутствие клеток). Никаких термических явлений, кроме внеклеточного остекловывания (-123°с) и объемного плавления образца, не наблюдалось.

Типичный след DSC клеток Jurkat (твердых линий) и клетк-свободного супернатанта (пунктирных линий) во время греть, и их производных первого порядка (серых) и второго порядка (черных). Оба образца отделяли центрифугированием от суспензии клеток Jurkat в культуральной среде с 10% (Об./об.) диметилсульфоксида. Их первоначально охлаждали при 2°C мин -1. до -150°С наблюдаются три различных термических события: внеклеточный стеклоподъемник (а), внутриклеточный стеклоподъемник (Б) и объемное плавление внеклеточного раствора (с). Следует отметить, что переход B, характеризующийся его началом, максимумом и концом, отсутствует в следе DSC бесклеточного супернатанта.

DSC медленно замороженных образцов CryoStor10 показал эндотермический диапазон центризованный на -122.5°C ± 0.6°c (n = 3), Типичный стеклянный переход DMSO ( Таблица 1 , Fig 3 и таблица для сырцового набора данных). Другое эндотермическое событие наблюдалось с его конечной точкой, расположенной в -70,0 ° C ± 0,4°C. оба пика могут либо отражать два последовательных тепловых события одного стеклования, где более низкое значение представляет температуру стеклования концентрированной фазы замораживания [ 18, 19] и более высокое значение представляет собой температуру размягчения, при которой система проявляет наблюдаемую деформацию (вязкое течение в реальном времени) под собственным весом [ 20], или они могут отражать тот факт, что эта криопротекторная смесь состоит из двух фаз, которые не полностью смешиваются. Добавление увеличивающихся количеств белка (альбумина) к Криостору 10 (без клеток) привело к исчезновению Tg’ ДМСО и появлению одного эндотермического события, соответствующего Tg’, при более высоких температурах. Endset этого перехода постепенно и значительно увеличенный с концентрацией протеина ( P < 0.01), достигая до -21.9°с ± 0,6°С на 50% мас. белковый раствор в Криосторе10 (Таблица 1 , Рис.3 и таблица S3 для необработанного набора данных).Производные первого порядка ДСК следы смесей Криостора10 и сывороточного альбумина при нагревании при 10°С мин -1 с последующим охлаждением при -10°С мин -1 .Следующие весовые проценты альбумина, растворенного в Криосторе 10, определяются по следовому цвету и составляют: черный-0%; серый-10%; серо-синий-20%; светло-голубой-30%; синий-40%; темно-синий-50%. Сырой DSC след CryoStor10 также включен (пунктирная черная линия).Таблица 1. Стекловые переходы характеризуются начальными, средними и конечными температурами в смесях альбумина, суспендированного в Криосторе 10 и измеренного ДСК при нагревании (n = 3 ± SD).Биологические переходы: конечные эксперименты Клеточные суспензии охлаждали с медленной контролируемой скоростью до диапазона температур перед переносом в жидкий азот. В первой серии экспериментов были исследованы конечные температуры между 4 и -100°C до погружения в LN. При -25°C или более высоких температурах наблюдалась высокая клеточная смертность после оттаивания и отсутствие пролиферации до 72 ч после оттаивания ( таблица 4A и S4 для исходного набора данных). Наоборот, когда образцы были перенесены к LN от -50°C или ниже, большое количество клеток выдержало (середина 8.8x10 4 ± 1.9x10 4 жизнеспособные клетки на лунку 24 ч после оттаивания) и были способны к пролиферации (среднее значение 13.1x10 4 ± 2.3x10 4 на лунку 72 ч после оттаивания). Все образцы погруженные в LN на ≤ -50°C имели значительно более высокое (P Начальная плотность клеток составляла 7.5x10 4 клетки на лунку сразу после оттаивания. При переносе в LN от -40°C выжило промежуточное количество клеток (4).5x10 4 ± 0.7x10 4 24 ч после оттепели), но они не смогли размножаться (4.2x10 4 ± 0.7x10 4 48 ч после оттепели). Данные метаболической активности после оттаивания следовали аналогичной схеме (рис.4B и таблица S5 для необработанного набора данных).Количество жизнеспособных клеток (A, C) и метаболическая активность (B, D) клеток Jurkat охлаждались при 1°C мин -1 для разделения конечных точек перед погружением в жидкий азот. Количество жизнеспособных клеток измеряли путем окрашивания диацетатом флуоресцеина и метаболическую активность оценивали путем снижения резазурина до флуоресцентного резоруфина через 24 ч (серый), 48 ч (белый) и 72 ч (черный) после оттаивания (n = 5 ± SD). Для метаболической активности интенсивность флуоресценции нормализовали до 1 при -50°С в течение 24 часов.В экспериментах с 2°с интервал в передаче температуре от -38°C и -50°C, низкое жизнеспособных клеток численности и метаболической активности были получены для клеток, которые были переданы в ЛН от -38°C, без распространения до 72 ч культуры (рис. 4C и 4D, а С6 и С7 таблиц для соответствующего базового набора данных). Наблюдалась тенденция с более низкой температурой переноса, приводящая к более высокой жизнеспособности клеток, образцы, перенесенные при -50°С, имели значительно более высокие (р < 0,01) числа жизнеспособных клеток, чем при переносе при -44°с, 48 и 72 ч после оттаивания ( рис. 4С и таблица S6). Аналогичная картина наблюдалась для значений метаболической активности (рис.4D и таблица S7).Обсуждение Известно, что фазовый переход мембранных липидов, наблюдаемый приблизительно на 5°С выше температуры зарождения и плавления льда во внеклеточном компартменте ( Рис.1), существенно не влияет на жизнеспособность клеток других типов клеток млекопитающих [ 21]. Он обратим, хотя и с небольшим гистерезисом, подчеркивая повышенный липидный конформационный порядок при нагревании, чем при охлаждении [ 22, 23]. Во время дальнейшего, введенного медленного охлаждения в присутствии внеклеточного льда, клетки Jurkat подвергали дегидратации, так как внеклеточная концентрация замораживания выводила воду из клетки. Последующее эндотермическое событие (событие B, Рис.2 ) было приписано внутриклеточному стеклоподъему (Tg'I, событие B, Рис. 2). Следует отметить, что этот сигнал витрификации, обнаруженный в клеточных суспензиях ДСК, отсутствовал в бесклеточных супернатантах и поэтому представляет собой клеточное событие. Наконец, внеклеточная среда остекловывается при -123 ° С. схематично иллюстрирует эти последовательные события, происходящие в суспензии клеток Jurkat во время равновесной криоконсервации в присутствии ДМСО.ноготь большого пальца Скачать: РРТ слайд PowerPoint формат PNG увеличить изображение РАЗМОЛВКА исходное изображение Рис. 5. Схема физических переходов, происходящих при криоконсервации клетки Jurkat в присутствии диметилсульфоксида.По мере снижения температуры (слева направо) клеточная мембрана сначала претерпевает фазовый переход из жидкокристаллической в гелевую фазу, при этом ее средняя точка находится на уровне приблизительно 0°С. При температуре приблизительно -7°С лед начинает зарождаться во внеклеточном пространстве, и с ростом кристаллов льда концентрация внеклеточного растворенного вещества увеличивается. Внутриклеточная вода вытекает из клеток в ответ на осмотический градиент. По мере дегидратации клеток внутриклеточный компартмент становится все более и более переполненным (синие и красные точки, символизирующие различные макромолекулы), пока он не подвергнется стеклянному переходу, начиная с -47°C. внутриклеточные макромолекулы теперь образуют сеть (связанные точки), аналогичную коллоидному стеклу, которая ведет себя как молекулярное сито, в котором нанопоры все еще остаются жидкими. При дальнейшем охлаждении внеклеточный компартмент и внутриклеточные нанопоры претерпевают Стекловой переход при -123°с (затемнение синего оттенка внутри - и внеклеточного компартментов). Ниже этой температуры молекулярная подвижность прекращается. Изображения клеток Jurkat адаптированы из Walter et al. [24 ].https://doi.org/10.1371/journal.pone.0217304.g005Здесь постулируется, что наблюдаемым эндотермическим событием в клеточных образцах является внутриклеточный стеклоподъемник максимально замороженного концентрированного внутриклеточного компартмента [ 6 , 7 ]. Можно исключить несколько альтернативных интерпретаций этого явления:Наблюдаемое событие не связано с липидами, поскольку i) фазовый переход мембранных липидов происходил при температурах, близких к нулю, как определено спектроскопией FTIR, и ii) клетки Jurkat не содержат липидов объемного хранения. Это также не является таянием внутриклеточного льда, так как высокая жизнеспособность клеток, полученная при оттаивании, несовместима с внутриклеточным образованием льда при охлаждении, согласно двухфакторной гипотезе Мазура [ 24 ]. Кроме того, прямые наблюдения за лимфоцитами человека при охлаждении показали, что внутриклеточный лед не образуется при скоростях охлаждения менее 5°C мин -1 [ 25]. Наконец, в настоящей работе применяемая скорость охлаждения слишком медленная, а скорость размораживания слишком быстрая, чтобы можно было проводить процессы девитрификации при нагревании [ 26 ].Возможность идентифицировать возникновение этого коллоидоподобного стеклования в медленно охлаждаемых клетках в ДМСО с помощью дополнительного метода к ДСК, тем не менее, была бы идеальной. Однако такой потенциальный аналитический или наблюдательный метод сегодня невозможен из-за низких температур и наличия льда. Представленные здесь данные, насколько нам известно, являются первым прямым доказательством внутриклеточного стеклования в клеточной суспензии млекопитающих, подвергающейся обычной криоконсервации и соответствующей биологическим результатам.Поскольку зарождение льда является стохастическим явлением, которое может препятствовать или изменять возникновение других тепловых событий, термограммы DSC обычно анализируются при нагревании [ 6, 7]. Таким образом, концевой набор термического перехода, идентифицированного при нагревании, можно рассматривать как начало во время охлаждения. Поэтому, во время охлаждать, клетки Jurkat начали бы пройти внутриклеточный стеклянный переход на температуре вокруг -47°C (endset Tg'I). Это значение согласуется с ключевым биологическим событием, которое происходит между -40°C и -50°C, при этом количество жизнеспособных клеток и метаболическая активность клеток полностью удаляются, когда перенос в LN происходит выше -40°C и относительно неповрежден ниже -50°C ( Рис.4).Середина этого перехода находилась на уровне -53,0 ° C ± 0,7°c, близком к значению -50°C, о котором сообщали Fonseca et al. в качестве внутриклеточного стеклования бактерий в присутствии ДМСО [ 7]. Изучение модельных растворов криопротектора с белком, имитирующим различное внутриклеточное содержание белка, позволило предвидеть поведение Tg'I в зависимости от внутриклеточного содержания белка (Рис.3). Более высокий Tg'I для более высоких внутриклеточных концентраций белка согласуется с более высоким содержанием белка в бактериях по сравнению с клетками млекопитающих [ 27 ].Как описано Чжоу и др. Для осмотически сжатых клеток стеклянный переход внутриклеточного компартмента, обусловленный повышенной плотностью упаковки внутриклеточных макромолекул (белков, полисахаридов, нуклеиновых кислот) и органелл, аналогичен коллоидному стеклу. Поскольку криоконцентрация эквивалентна осмотическому сжатию клеток с точки зрения удаления воды и увеличенной внутриклеточной плотности упаковки, эндотермическое событие, происходящее в медленно охлаждаемых клетках Jurkat при -47°C, может быть также описано как аналогичное коллоидному стеклу. Считается, что макромолекулы в суспензии в цитоплазме клеток образуют это коллоидоподобное стекло [ 8 , 28 ], которое можно рассматривать как сетку иммобилизованных макромолекул из-за большого увеличения вязкости, связанного со стеклом. Это стекло заперло бы некоторую воду, DMSO и другие малые молекулы (ионные виды, метаболиты) между сеткой стеклянных макромолекул, которые остали бы жидкостными когда коллоид-как стеклянные формы. Образование внутриклеточного стекла также сделало бы мембрану более жесткой, поскольку она состоит из белков с цитоплазматическими и мембранными доменами. Пока малые молекулы могут двинуть внутри это внутриклеточное коллоид-как стекло, взаимодействие с внеклеточной окружающей средой строго сокращено. Клетки больше не могут обезвоживаться и поэтому находятся в максимально обезвоженном состоянии, обеспечивая максимальную защиту от внутриклеточного образования льда.После того, как клетка внутри остеклится, ожидается, что клетка будет осмотически невосприимчивой. Коллоидное стекло ведет себя как молекулярное сито, в случае Е. coli [ 9], позволяющая свободное прохождение небольших молекул, таких как глюкоза (MWt 180), ограничивая диффузию более крупных, таких как зеленый флуоресцентный белок GFP, белок 24kDa с цилиндрической формой длиной 4,2 Нм и диаметром 2,4 Нм [29 ]. Поскольку белки обычно варьируют в размере от 2-10 Нм [ 30], средние размеры пор в обезвоженном состоянии составляют порядка лишь нескольких Нм. Ожидается, что образование внутриклеточного стекла во время концентрации замораживания не приведет к значительному изменению осмоляльности остаточного внутриклеточного раствора или его объема. Ожидается, что концентрация замороженного концентрированного ДМСО будет составлять 50% с вязкостью порядка 100 МПа.s [30]. Ожидается, что этот остаточный внутриклеточный раствор изменит состояние (либо на стекловидное, либо на зародышевое в виде льда) во время последующего охлаждения. Образование внутриклеточного стекла не устраняет проблему образования внутриклеточного льда, но изменяет его геометрию от одного внутриклеточного компартмента до нескольких нанопор внутри коллоидоподобного стекла. При этом происходит переход от микропористого к нанопористому ( Температура плавления может быть дополнительно снижена до температур, значительно ниже температуры гомогенного замерзания объемной воды, как было показано с нанопористым кремнеземом [ 31 ], цеолитами [ 32 ], силикагелями, а также воздушными нанодроплетами [ 33]. В случае внутриклеточного коллоидоподобного стекла степень этого эффекта может также зависеть от влияния высококонцентрированных растворенных веществ, которые, как можно ожидать, будут способствовать витрификации небольших объемов в порах. Важность внутриклеточного стеклования для выживания клеток при низких температурах заключается в том, что этот переход не связан с изменением объема и плотности, сопровождающим зарождение и замораживание льда, а ингибирует объемное внутриклеточное ледообразование. Клетка, в которой внутриклеточный компартмент замерзает, подвергается механическим стрессам, которые часто являются смертельными, и основной причиной смерти клетки во время криоконсервации [ 1 ]. Однако клетка, в которой образуется внутриклеточное стекло, ведет себя эффективно как твердое вещество и сохраняет свою внутреннюю структуру и целостность. Тот факт, что эти клетки обладают высокой жизнеспособностью при оттаивании, свидетельствует о том, что внутриклеточный стеклование не является смертельно опасным событием.Температурный диапазон между внутриклеточным и внеклеточным стеклоподъемом будет определяться содержанием белка в клетке, а также ее дегидратацией при охлаждении. Более высокая концентрация протеина, и большое обезвоживание приведут к в более высоком Tg'I ( Fig 3 ). Если замораживающая среда содержит высокий уровень белка (например, среды с высокими фракциями альбумина или сыворотки), эта среда также может подвергаться стеклования перед событием ДМСО при -123°C.В этой статье мы сосредоточились на физических переходах, которые происходят при обычной криоконсервации клеток Jurkat в 10% ДМСО (схематически резюмировано на Рис. 5) и имеют значительные последствия для его успеха. Как правило, ячейки охлаждают с контролируемой медленной скоростью до -80°С или ниже, прежде чем перевести их в жидкий азот или его пар. Эта работа обеспечивает научное основание для того чтобы показать что эта передача не должна commencebeforore приблизительно -50°C (учитывать термальные зыбкост во время перехода), хотя бы для клеток Jurkat в 10% DMSO, и более низкие температуры как -60°C обеспечат робастный термальный буфер в случае греть во время перехода. Пока только клетки Jurkat были рассмотрены в этом изучении результаты правоподобны для того чтобы примениться к другим культивированным линиям клетки cryopreserved в присутствии к DMSO, должному к подобным уместным физическим характеристикам. Следует также отметить, что образование внутриклеточного стекла во время охлаждения само по себе не обеспечивает долговременную стабильность клетки. Вода и растворенные вещества, такие как ионные частицы и метаболиты, могут быть подвижными внутри пор во внутриклеточном стекле, и реакции разложения могут все еще происходить там или между внеклеточным компартментом и клеточной мембраной. Следовательно, долговременная стабильность в замороженном состоянии достигается ниже как внеклеточного Tg’, так и Tg’ водного отсека во внутриклеточном стекле, т. е. ниже -123°С.